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实验一 基因组组装

一、实验目的

  1. 熟悉使用高性能计算机集群
  2. 熟悉基因组从头组装原理及步骤
  3. 掌握velvet, minia, SPAdes等短序列拼装软件使用
  4. 熟悉用quast评价组装效果

二、基因组组装组装原理与方法

两种策略

  1. Overlap/layout/consensus
  2. De Bruijn k-mer graphs

第一种策略主要应用在长reads组装上，如sanger测序数据和第三代测序数据，组装软件包括phrap, cap3等。 第二种策略主要应用于短reads数据组装上，包括velvet, soapdenovo, ABYSS等。

Overlap/layout/consensus基本步骤

  1. Calculate all overlaps. 计算重叠片断
  2. Cluster based on overlap. 重叠片断聚类
  3. Do a multiple sequence alignment. 多序列比对,取一致序列

De Bruijin k-mer graphs基本步骤

  1. Building the k-mer graph，构建k-mer图，有的软件会在之前加一步，对reads进行纠错
  2. Construct contigs，搜索路径
  3. Scaffolding and fill gaps，构建scaffold并填洞

本实验主要介绍使用第二种策略的组装软件velvet, minia和SPAdes的使用

如何选择合适k

  1. 多试几个k，看组装效果
  2. 利用如KmerGenie进行辅助选择

如何选择组装软件

  1. 选择你熟悉的软件
  2. 选择大家使用多的软件
  3. 选择适合项目性质的软件，如基因组大小，染色体倍性，杂合度，数据类型，宏基因组，转录组等

浏览软件库

三、上机操作

设置环境变量和工作目录

#新建一个目录lab1，本实验所有数据和输出都放入该目录中  
mkdir lab1
cd lab1
mkdir data
mkdir result

数据存放位置

数据存放在服务器位置：
/data/lab/genomic/lab01/data/reads_1.fq.gz
/data/lab/genomic/lab01/data/reads_2.fq.gz
#参考基因组
/data/lab/genomic/lab01/data/ref.fa

组装

准备数据

cd data
ln -s /data/lab/genomic/lab01/data/reads_1.fq.gz /data/lab/genomic/lab01/data/reads_2.fq.gz ./
cd ../result

估算k值

$ ls ../data/reads_* > reads.file

新建一个脚本文件，work_kmer.sh，写入以下内容:

#!/bin/bash
#$ -S /bin/bash
#$ -N kmer
#$ -cwd
#$ -j y
/opt/bio/kmergenie-1.7048/kmergenie reads.file

结束后查看结果，选择最优k值57

1. 用velvet组装

新建一个脚本文件，work_velvet.sh，写下下列内容:

#!/bin/bash
#$ -S /bin/bash
#$ -N velvet
#$ -cwd
#$ -j y
velveth ecoli.velvet 57 -shortPaired -fastq.gz -separate ../data/reads_1.fq.gz ../data/reads_2.fq.gz
velvetg ecoli.velvet -exp_cov auto

2.用minia组装

新建一个脚本文件，work_minia.sh，写入下列内容:

#!/bin/bash
#$ -S /bin/bash
#$ -N minia
#$ -cwd
#$ -j y
/opt/bio/bin/minia -in ../data/reads_1.fq.gz,../data/reads_2.fq.gz -kmer-size 57 -out ecoli.minia

3. 用SPAdes组装

新建一个脚本文件，work_spades.sh，写入下列内容:

#!/bin/bash
#$ -S /bin/bash
#$ -N spades
#$ -cwd
#$ -j y
spades.py -t 4 -1 ../data/reads_1.fq.gz -2 ../data/reads_2.fq.gz -o ecoli.spades

组装效果评价

quast -R /data/lab/genomic/lab01/data/ref.fa \
   ecoli.velvet/contigs.fa \
   ecoli.minia.contigs.fa \
   ecoli.spades/scaffolds.fasta

查看评价结果

less quast_results/latest/report.txt

四、作业

  1. 不同k-mer值对组装的影响，对velvet和minia用31和57进行组装，比较组装效果
  2. 熟悉和理解基因组组装一些术语名词，如N50, NG50, contig, scaffold, gap等
  3. 理解k-mer频次分布图，如何根据k-mer频次分布图估算基因组大小及杂合度

五、参考文献